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            点击次数:412 发布时间:2017-03-27

            Western blot发光检测中常见的问题及解决方法

             免疫印迹试验(Western blot)是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法,被广泛应用于蛋白表达水平的研究、抗体活性检测和早期疾病诊断等多个方面。其中较为简单也为大家所普遍接受的Western blot显色方法为底物化学发光法ECL。

             

            众所周知,Western blot的原理是蛋白质在电力场的作用下,由大到小的进行排列,利用电泳进行分离和富集。拥有抗原表位的蛋白质分子被抗体(一抗)特异性识别并与之结合。在此基础上,酶或荧光标记的二抗识别并结合一抗,通过与底物反应显色来观察目的蛋白。
             
            Western blot显色的方法主要有以下几种:
                 一、放射自显影;
                 二、 底物化学发光ECL;
                 三、底物荧光ECF;
                 四、底物DAB呈色。
             
            现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色。大部分Western blot显色底物是化学发光底物,发表文章通常也是用底物化学发光ECL。
             
            ECL法检测辣根过氧化物酶的原理是辣根过氧化物酶在H2O2存在下,氧化化学发光物质鲁米诺(lumino,氨基苯二酰一肼)并发光,在化学增强剂存在下光强度可以增大1000倍,通过将印记放在照相底片上感光就可以检测辣根过氧化物酶的存在。ECL法操作简便,应用现成的试剂盒(abs920),按照说明,将两种显色底物等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀,用玻璃胶片把膜包起来,马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面,显影、定影(或用荧光检测仪检测)。ECL法具有灵敏度高,线性范围广等特点。

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